DNA AŞISI NEDİR ? NASIL ELDE EDİLİR ?

DNA aşısı, aşı olarak kullanılan DNA dizisidir. Bu tür aşılarda proteinin kendisini veya bir patojenin zayıflatılmış/ölü formu kullanılmaz. Bunun yerine patojen proteinini kodlayan genler kullanılarak diğer geleneksel aşılara göre büyük bir avantaj sağlanır. Bir hücreye enjekte edildiğinde antijenik protein translasyonu (sentezi) meydana gelir. İmmun yanıt bu proteine karşı harekete geçer. Çünkü sentezlenen bu yeni proteini hücre yabancı bir molekül olarak algılar. Ve böylece enjekte edilen DNA sekansı ile hem hücresel immünite (yardımcı T lenfositleri yanıt verir) hem de hümoral immün (B lenfositleri etkilidir) yanıtlar oluşturulur. DNA aşılarında sadece enfeksiyona neden olan organizmaların DNA’sı kullanıldığı için gerçek enfeksiyon oluşturan organizmanın kullanım riskini önler. Böylece ölümcül olabilen muhtemel riski ortadan kaldırmış olur. Geleneksel aşılara göre bir diğer avantajı da refrigeration (soğutma) gerektirmemesi ve depolama yapıldığında bozulmamasıdır. Böylece uzun süreli kullanılabilir. Şu anda piyasada insanların kullanabileceği DNA aşısı bulunmuyor. Ancak bazı hayvanları korumak amacıyla geliştirilen DNA aşısı mevcut olabilir.

PEKİ BİR DNA AŞISINI NASIL ELDE EDEBİLİRİZ?

Gerek geleneksel aşılar için gerekse DNA aşılarını geliştirmek için en önemli basamaklardan biri antijenik hedefin belirlenmesidir.Bir diğeri de elde edilen antijenin vücuda verildiği esnada kullanacağımız strateji. Bunun sebebi ise hedef mikroorganizmalar immün sisteme çok sayıda antijenik hedef sunar ancak bunlardan az bir kısmı koruyucu immün yanıtı harekete geçirir. İşte bu yüzden bu iki basamak önemli yer tutar. Bir DNA aşısı elde etmek aynı zamanda istediğimiz bir proteini üretmek anlamına geliyor. Yani burada rekombinant DNA teknolojisi (klonlama) kullanılır.

DNA aşısı elde etmenin 4 temel basamağı vardır. İlk önce antijenik hedef belirlenir sonra klonlama yapılır daha sonra plazmit izolasyonu (bakteriden endotoxin free olacak şekilde) yapılır. En son tuz solüsyonunda çözdürülür ve hiç olmayanla karşılaştırılması sağlanır.

Şimdi daha iyi anlaşılabilmesi için bu 4 temel maddeyi inceleyelim.

  • Antijenik hedefin belirlenmesi ve dizisinin ortaya çıkarılması: Hedef diziyi kodlayan geni taşıyan organizmadan antijenik dizi ortaya çıkarılır. Ortaya çıkarılan dizide izolasyon yapılır. Eğer ökaryotik bir organizma ise önce intronlardan (kodlama yapmayan nükleotid dizileri) kurtulmak gerekir. Bunun için total RNA izolasyonu yapılarak reverstranskriptaz (ters transkriptaz) enzimi ile mRNA’dan cDNA (komplementer DNA) elde edilir. Kromozom DNA’sı izolasyonu yapmak için fiziksel (mekanik) ve kimyasal (liziz) olmak üzere iki yöntem kullanılır. Fiziksel yöntemlerden; osmotik şok, Fransız basınç hücresi, dondurma-eritme, aşındırıcılar ile agitasyon (balistik), ultrasonikasyon vb. yöntemler kullanılırken kimyasalda ise litik enzimler, detarjanlar ve çözgenler sıklıkla başvurulan enzimatik yöntemlerdir.
  • Primer dizaynı yapılır: İzolasyon basamağından sonra DNA miktarının uygunluğu ve saflığı kontrol edilir.Ortaya çıkarılan diziye özel primer dizaynı yapılır. Burada dikkat edilmesi gereken şey genin uçlarında vektörde belirlediğimiz enzim tanıma bölgelerini içerecek şekilde olmalıdır.
  • Enzim seçimi:Geni iki farklı şekilde kesmeyecek şekilde enzim (reverstranskriptaz) seçimi yapılır ve dizayn edilen primerin uçlarına bu enzim takılır.
  • PCR (polimeraz zincir reaksiyonu) yapılır: Bu özgül bölgeyi çoğaltmak amacıyla PCR (polymerase chain reaction) yapılır. Ve aynı enzimle seçilen vektör ve gen kesilir. Burada kesme işleminin yapılmasının sebebi kopyalanacak olan DNA parçalarının konak hücresine doğrudan girememesi.

Not:

Vektör, kendisiyle birleştiren bir DNA molekülünü bağımsız bir şekilde replike edebilen DNA parçasına denir. Vektörler bir takım özelliklere sahiptirler; DNA parçalarının insersiyonu olabilmesi için tanıma dizisi içerirler, seçicilik sağlayan markır genler bulundururlar ve taşıdıkları DNA parçalarını ve aynı zamanda kendilerini bağımsız replike edebilme kabiliyetleri vardır.

  • Kesme işleminden sonra vektör ve gen ligasyon yöntemiyle birleştirilir: Ligasyon karışımının içerisinde istenilen rekombinant moleküle ek olarak, bağlanamamış DNA fragmantleri, yeni DNA insört edilmeden tekrar kendine bağlanan vektör molekülleri, bağlanamamış vektör molekülleri, yanlış bir şekilde insört olmuş DNA molekülleri bulunabilir.
  • Klonlama konakçısına tranformasyon (aktarım) yapılır: Bu işlemden önce hücreler kompatent hale getirilir. Burada hücreler soğuk tuz çözeltisinde( kalsiyum klorür) bekletilerek bu sayede DNA alma yetenekleri arttırılmış olur. Daha sonra tranformasyon yöntemlerinden ısı şoku veya elektroporasyondan birini kullanarak klonlama konakçısına aktarım yapılır.
  • Rekombinant DNA seçilimi yapılır: Konak hücreye muhtemel geni aktardıktan sonra istenilen özellikleri bulunduran geni taşıyan rekombinant hücrelerin seçilmesi klonlamanın en önemli basamaklarından biridir. Burada üç yöntem kullanılır.

1) Genetik (fenotipik) seçim yöntemleri: bu yöntemde konak hücrede bulunan rekombinant  genlerin özellikleri gözlemlenebilmesi açısından avantaj sağlar.

 2)Nükleik asit melezleme yöntemleri: istenen genin anlatım yapma ihtiyacı yoktur. Rekombinant DNA alan vektörün doğrudan DNA varlığının tespiti yapılır. Bunun için koloni/plak melezlemesi ve tek koloni lizat yöntemleri ile yapılır.

 3) immünokimyasal seçim yöntemi: genin anlatım yapması ile istenilen rekombinant DNA seçilimi yapılır. Bu sayede fenotipik özelliğe yol açmayan genlerin seçimi de yapılabilir.

İstenilen genin orada olup olmadığına tam olarak emin olabilmek için önce kolini ve çapraz PCR hemen ardından dizi analizine yollanır. Ve gelen sonuçlara göre istenilen rekombinant geni taşıyan vektör belirlenir.

Bakteriden endotoksin-free olacak şekilde plazmit izolasyonu yapılır:

Plazmit izolasyonu iki şekilde yapılır;

 1) Büyüklüğüne göre ayırma; bu yöntem plazmit DNA’sı ve kromozomal DNA’yı birbirinden ayırmak için yeterli değildir. Özellikle de plazmitlerin kendileri büyük moleküller ise onlar da kromozomal DNA’larla beraber lizat sırasında çökeceklerdir.

2)Korformasyona dayalı ayırma; bu yöntem sıklıkla kullanılır. Burada plazmitlerin farklı konformasyonuna sahip özelliğinden yararlanılır. Büyüklüğüne göre ayırma yöntemi tek başına kullanılırsa verimli olmaz. Bundan dolayı her iki yöntem birlikte kullanılması tavsiye edilir.

  • Tuz solüsyonunda çözdürme: Plazmit DNA’sı saf bir şekilde elde edildikten bu işleme geçilir. Ve DNA aşısı elde etmiş olunur.

Bundan sonraki süreçte elde edilen DNA aşısının test edilmesi gerekir. Bunun için öncelikle bir iletim yöntemi seçilir.(enjektör, gen tabancası, elektroporasyon, lipozon vb.) daha sonra doz ayarlaması için nanodrop miktar ölçümü yapılır. Karşılaştırma yapmak için ve ifade edilip edilmediğini anlaya bilmek için çeşitli analiz yöntemlerine başvurulur. En sık kullanılan yöntemlerin başında Western blot tekniği gelir.

DNA AŞILARI NASIL ÇALIŞIR?

Elde edilen DNA aşıları vücuda girdikten sonra endojenik yol ve eksojenik yol olmak üzere iki metabolik yol ile çalışır. Endojenik yolda antijenik protein hangi hücrede üretilmişse yine o hücre tarafından sunulur. Eksojenik yolda ise durum biraz farklıdır. Antijenik protein bir hücre tarafında üretilir, şekillendirilir. Ancak tamamen farklı başka bir hücre tarafından sunumu yapılır.

Yazar Hakkında

Yorum Ekle